电泳和蛋白印迹干货总结

1. 什么是蛋白印迹？
蛋白印迹，又称western blotting或（蛋白）免疫印迹，是指将蛋白质从SDS-PAGE电泳凝胶转移到PVDF或硝基纤维素膜上，然后使用带有荧光或化学发光检测的抗体对蛋白质进行免疫检测。
蛋白印迹是细胞和分子生物学的核心技术，主要用于靶标蛋白特异表达分析，蛋白与蛋白或蛋白与DNA相互作用的后续分析，以及抗体活性检测等。

2. 蛋白印迹实验有哪些关键步骤？
蛋白印迹实验的步骤主要包括样品制备、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影（或荧光成像）和图像分析。
每一个步骤的质量都会影响最终的结果，因此可以说都是关键步骤，一定要避免厚此薄彼的心理。建议把每个步骤都作为一个节点，关注每个节点需要注意的事项。 只有控制好每个节点的质量，才有可能最终获得一个漂亮的实验结果。

3. 如何准备用于WB实验的组织样本？
用干净的工具采集和处理组织样本，在冰冷的中性pH缓冲液中进行短暂清洗，以去除可能影响蛋白质稳定性的污染物。洗涤后，在液氮中快速冷冻组织，以保存蛋白质结构和功能，如翻译后修饰（PTM）。
组织样本可以放置在冰上，然后立即均质或以其它方法破碎，或者转移至-80℃长期保存。尽量快速完成整个过程。

4. 组织样本破碎有哪些需要注意的？
均质技术、物理破碎（反复冻融、超声）、有机溶剂或酶解等破碎方法对结构化程度更高的组织样本是必要的。
在操作过程中主要注意发热引起的蛋白变性和聚集，全程在低温下进行。在超声处理步骤中避免起泡非常重要，因为这可能会降低回收量。脂质会影响蛋白质印迹的质量，应确保从样本中去除脂肪。从植物组织中提取蛋白更具挑战性，需要特定的优化方案。

5. 如何选择裂解缓冲液？
首次建立蛋白提取方案时，可尝试不同的裂解缓冲液，看哪种是最优的。应考虑pH值、离子强度、去垢剂和变性剂类型等参数，并考虑目标蛋白的细胞定位。
RIPA是应用最广泛的裂解缓冲液，优先用于提取核蛋白质。对于细胞质蛋白，建议使用Tris-HCl。对于细胞膜、胞浆或核部分的低丰度蛋白质，为获得更好的效果，可能需要先通过亚细胞分离富集。

6. 裂解液中为什么要加蛋白酶等酶类抑制剂？
细胞膜被破坏后，释放出可降解蛋白质的酶，尽管低温操作已使其活性降至最低，但仍足以降解目标蛋白。
为了限制蛋白酶的活性，裂解缓冲液通常会补充蛋白酶抑制剂混合物。常见的蛋白酶抑制剂包括（PMSF）、抑肽酶、亮蛋白肽和胃蛋白酶抑制剂。对于苏木酰化、泛素化等研究，也需要添加相应的抑制剂以避免蛋白质降解并保留翻译后修饰。

7. 样品电泳前需要进行蛋白定量吗？如何定量？
如需比较处理与未处理样品或不同实验时间点蛋白质水平的差异，应先测定蛋白浓度，然后调整到相同的蛋白量上样。
Bradford法和BCA法是常用的两种定量方法，它们对样本中干扰物质的适应性不同。
BCA法适合样品含有大量去垢剂但不含螯合剂、还原剂的场合，而Bradford法适合含EDTA等金属螯合剂或者含有还原型物质但不含去垢剂的样品。

8. 如何选择电泳凝胶？
首先，根据目标蛋白分子量选择(C3H5NO)n百分比，高分子量选低浓度胶，低分子量选高浓度胶。如需区分宽分子量范围的蛋白，可选择梯度胶。
其次需要考虑凝胶的缓冲体系，如15kD以下的蛋白，优选Tris-Tricine胶，10-250kD的蛋白可选择Bis-Tris胶，对250kD以上的大分子靶标，建议采用 Tris-Acetate凝胶。

9. 什么是预制胶？使用预制胶有什么好处？
预制胶是商品化的蛋白质电泳凝胶
通过机器灌制批量生产，胶与胶间重复性好，质量稳定，避免了手工灌胶的差异性，以及配胶不均匀、不小心漏胶等问题，为蛋白电泳提供了一种便捷的选择，既能节省时间，又容易获得高质量的可重复结果。实验人员无需再接触任何有毒试剂，体验感和安全性大大改善。预制胶还有多种梯度胶可供选择，这是手工配胶不容易实现的。

10. 哪种凝胶体系更好？
Tris-甘氨酸和Bis-Tris是两种常用的凝胶体系。
当蛋白质丰度较低或下游应用需要高蛋白质完整性（例如翻译后修饰分析，质谱或测序）时，建议选择 Bis-Tris体系。
Bis-Tris 体系在电泳过程中可提供中性pH环境，有助于提升样品完整性和凝胶稳定性。这有助于减少对蛋白质修饰的影响，并带来更清晰锐利的条带，也利于凝胶保存。

11. 上样缓冲液有哪些成分？分别起什么作用？
通常用0.02%染料溴酚蓝作示踪剂。
2%的SDS溶解蛋白质的疏水区域并打破非共价离子键，使蛋白质失去球状结构并线性化，同时包覆蛋白质，使其具有与分子量成比例的均匀负电荷。
10%甘油可增加样品密度，使样品沉至上样孔底而不至于飘散造成上样不均。
还原剂（5%β-ME或0.3M DTT）破坏二硫键，保证蛋白完全基于分子量线性化分离。

12.上样前为什么要煮沸蛋白样品？
对变性和还原样品，加热可确保样品真正变性。此外，加热会使样本从DNA和细胞碎片中释放出粘稠物质，使样本更容易上样。
一般是在95–100°C下煮沸混合物5分钟，或者2-10分钟。对多次跨膜蛋白，更适宜在70°C下加热5–10分钟，因为煮沸易造成这些物质聚集，而聚集物不易进入凝胶。如需进行非变性电泳，则不能加热样品。

13. 样品中哪些问题会影响凝胶电泳条带质量？
蛋白上样量过高，可引起条带分辨率低，泳道有纵向条纹且不直。
过量硫酸铵可引起泳道边缘有纵向条纹，哑铃型条带，或泳道变宽。
样品过粘（DNA引起聚集），可导致形状诡异的狭窄泳道。
盐离子浓度过高（氯化钠），去垢剂浓度过高，高浓度的RIPA缓冲液，都可能引起泳道宽度不一致，泳道变宽。
裂解液或样品缓冲液中还原剂过多，可导致泳道边缘有阴影。

14. 为什么要选择预染marker？跟未染marker比有缺点吗？
预染marker除了起分子量标准品的作用，还可实时监控电泳过程中蛋白在凝胶上的迁移，并能直观指示后续转印步骤中的转膜效率，自然是较好的选择。
但预染marker价格较贵，染料的添加可能影响蛋白迁移率，并改变印迹过程中吸附到膜上的能力因此，预染marker指示的分子量相对未染marker来说，没那么准确，只适宜作粗略的判定。

15. 如何选择电泳缓冲液？
应根据凝胶体系选择电泳缓冲液，对Tris-甘氨酸凝胶，选择Tris-甘氨酸缓冲液（非变性电泳不加SDS）。
对Bis-Tris SDS-PAGE凝胶，可选择MES或MOPS缓冲液。
MES的pKa比MOPS低，这使得电泳跑得更快。 MES缓冲液对较低分子量的蛋白质分离效果更好，而MOPS缓冲液更适合分离分子量较高的蛋白。

16.SDS-PAGE电泳应选择恒定电流还是恒定电压，或者恒定功率？
这是一个有争议的话题。
恒流使电泳条带以恒定的速度迁移，速度较快且时间可控，同时条带更尖锐。
但随着电阻的增加会产生更多热量，导致“微笑”条带或变形凝胶，甚至导致蛋白无法检测。为此常在冰上进行电泳。
恒压时产热相对较少，但由于电流随电阻增加而减小，导致速度变慢，使得时间不确定，且条带较弥散。
恒定功率安全性最好，但电泳时间更加无法预测。

17. 如何选择转印膜？
根据膜材质的特性进行选择，考虑蛋白结合能力、溶剂抗性、是否需要醇预湿、能否多次剥离再检测、蛋白观测、印迹保存和信噪比。
PVDF和NC膜是最常用的两种膜
【PVDF因蛋白结合能力强、物理强度好和化学兼容性广等优点成为首先选择。NC膜最主要的优点包括较高的信噪比、不需甲醇预湿，以及价格便宜，另外其自发荧光也较低，缺点是强度和耐溶剂性能差。】

18. 据说PVDF膜还有多种选择？
比如默克密理博提供4种PVDF膜—Immobilon-P是通用型
Immobilon-PSQ孔径0.2μm，蛋白结合力和截留率比通用型提高50%以上，更适合20kDa以下的蛋白
Immobilon-FL针对荧光免疫检测进行优化，背景极低
Immobilon-E则是经过工艺改良后的即用型PVDF膜，使用前无需甲醇预湿润

19. 如何选择转印缓冲液？
转印缓冲液提供导电性能和蛋白转移的化学环境，通常需考虑与凝胶系统的兼容性。
Tris-甘氨酸是湿转最常用的缓冲液，Bis-Tris转印缓冲液可维持中性pH条件，保护氨基酸侧链不改性，并与Edman降解的N-末端蛋白测序兼容。半干式转印通常需要高离子强度缓冲液，可以购买商品化的缓冲液或加大浓度，如使用2×Bis-Tris转印缓冲液。

20. 转印缓冲液中为什么要加入甲醇？
主要有两个目的：
稳定凝胶的尺寸和从蛋白分子上解离出SDS。生物凝胶P (Bio-Gel P)具有吸水溶胀的特性，浓度越高溶胀越多。甲醇可最大限度地减少凝胶溶胀，并帮助从蛋白上解离所复合的SDS。
SDS的结合给蛋白带来高密度负电荷，导致蛋白快速穿膜，减少在孔结构内停留和相互作用的机会，并直接限制了蛋白与膜的接触。因此，加入甲醇增强了蛋白质与膜的结合。

21. 什么是湿转和干转？如何选择？
湿转又称槽式转印，就是把三明治结构浸入电泳槽转膜液中转印；半干式转印通过滤纸浸泡转膜液进行转印，而干式转印不需要转膜液。
湿转易于控制，效率高但费时费力。干转简便、省时，转膜液用量少，因而在需要进行大量转印的场合较受欢迎。因缓冲容量有限，干转不适合大分子（>300kDa）蛋白转印。干转不便控温，需要考虑蛋白热变性对下游应用的影响。

22. 哪些因素会影响转膜的效率？
① SDS。SDS会影响蛋白与膜的结合，但有时需要加少量SDS以增加蛋白溶解度或防止疏水蛋白沉淀。
②电流和转印时间。电流过低或时间不足将导致转印不彻底，电流过高则可能导致穿膜太快来不及吸附，对小分子蛋白尤其如此。时间过长可能导致过度转印。
③缓冲液pH值。应避开蛋白等电点。
④平衡时间。凝胶平衡应保证SDS在转印缓冲液中充分扩散。

23. 有没有可能在不影响后续步骤的前提下看到膜上的蛋白条带？
可以用可逆染料染色后观察，如丽春红、CPTS、Sypro® Ruby等，最常用的是丽春红，通过0.1N NaOH清洗可彻底去除丽春红。
对PVDF膜，也可以在将膜彻底干燥后用透照法进行观察。含有转印蛋白的PVDF膜区域能够在20%的甲醇中浸湿而逐渐变得透明，而其余区域不会，可用背光照相法进行观察和记录。此方法完全可逆。

24. 免疫检测应该选择PBS还是TBS作为缓冲液？
最保险的方法是采纳抗体供应商的建议。
在大多数情况下，PBS和TBS缓冲液在很大程度上可以互换，不影响实验结果。PBS适应性更广，然而，磷酸根可干扰碱性磷酸酶（AP）偶联的二抗，或者与磷酸特异性一抗结合磷酸化蛋白形成竞争，造成低信号和高背景。因此，如果二抗是碱性磷酸酶偶联抗体，或者WB检测的是磷酸化蛋白，应该使用TBS缓冲液。

25.为什么要进行封闭？如何选择封闭剂？
要获得有意义的结果，必须保证抗体只与感兴趣的蛋白结合而不与膜结合。利用惰性蛋白、非离子去污剂或无蛋白封闭剂来封闭膜上未被占据的位点，可减少抗体的非特异结合。这就是封闭的意义。
最常用的封闭剂包括血清、BSA，脱脂牛奶、酪蛋白、明胶、吐温20等，以及商业化封闭剂。选择封闭剂应注意避免替换或掩盖目标蛋白，且须与检测试剂兼容。

26.使用脱脂牛奶作封闭剂有什么问题？
脱脂牛奶不能用于生物素化或刀豆蛋白标记的抗体，因为牛奶中含有生物素和糖蛋白。
脱脂牛奶也不适用于磷酸化蛋白的检测分析，因为牛奶中含量丰富的酪蛋白是一种磷酸化蛋白，将造成高背景。同时牛奶中还含有磷酸化酶，可将印迹上的磷酸化蛋白去磷酸化，同样影响分析。
此外，脱脂牛奶有可能掩盖某些抗原位点造成信号弱。
在牛奶中长时间封闭易长菌并产生沉淀。

27. 印迹膜背景过高有哪些原因？
抗体问题（浓度过高、孵育温度过高、特异性差等）
封闭和洗涤问题（封闭不足、封闭液有干扰、漂洗不充分）
印迹膜问题（干燥、污染、破损、叠放等，PVDF比NC膜背景高，尤其是0.2μm膜）
设备或材料被污染（如缓冲液重复使用）
化学发光底物信号太强（底物灵敏度过高、孵育后未完全去除、孵育或曝光时间过长等）…
这些原因都可能导致高背景。

28.为何印迹膜上有污迹或斑点？
印迹背景有污迹：最可能的原因是印迹膜部分变干或洗涤不均匀。抗体孵育不均匀或膜污染也可带来污迹。
印迹背景有斑点：最可能的原因是外来杂质附着于印迹膜之上，比如残留的凝胶、聚集的二抗、成块的封闭剂等。扫描装置或盒表面脏污也可能导致出现斑点。如果转膜时未排尽气泡，可能带来空斑。
规范操作并避免以上问题，就能得到一张干净无瑕的印迹膜。

29.为什么会出现非特异性条带（杂带），或者大小不对？
抗体（尤其是一抗）浓度过高，抗体特异性不好，凝胶上样量过高，化学发光底物信号太强（孵育或曝光时间过长、孵育后未完全去除，二抗浓度过高等）可能导致杂带。
若蛋白存在糖基化或其它翻译后修饰；变性不完全，仍保留二硫键，或产生聚体，带分子量更高。
若蛋白发生降解，或一抗识别剪切变异体，或一抗识别了其它蛋白的相似表位，可导致出现低分子量条带。

30. 为什么我的条带变形了？
常见的变形条带包括边缘向上拖尾的“微笑”带、宽且模糊的弥散带、沿多个方向拖尾的条纹带等。
“微笑”带形成的原因可能是电泳电压过高以及凝胶过热，或者上样量过大；出现条纹或弥散带的原因是转印时胶和膜接触不完全（未贴紧），或者膜发生移位；条带模糊的可能原因包括凝胶电泳电压过高，loading buffer过期变质，或转印时没有赶尽气泡。

31. 为什么我的条带是白色的？
有时候目标条带中央或整个条带都是空的，或者只有一圈光晕，看上去是白色条带，或者像“负片”——膜是黑色，而条带是白色。这种通常被称为“鬼带”。这种现象可能表明了白色区域的底物已被耗尽，往往是抗体或抗原浓度过高引起的。
需要排除以下几种原因：一是检测时过度曝光，二是电泳上样量过大，三是抗体浓度过高。此外，不要在转印过程中移动装置。

32. 信号微弱甚至没有信号是什么原因？
可能的原因有：样品不足、样品表位被破坏（某些蛋白不能跑还原电泳），凝胶选择不当、转印装置未正确组装、转印buffer不合适、转印不足或过度转印、PVDF膜未正确湿润、蛋白与膜结合不充分、抗体不匹配、亲和力低或浓度不够、封闭过度或封闭剂遮盖了抗原位点、洗涤过度、HRP标记抗体被叠氮钠抑制、曝光时间或底物孵育时间太短、底物失效等等。

33. 我的目标蛋白分子量较大，有什么需要注意的？
超过100kDa的蛋白往往因为某些原因带来检测的难度
建议：
1）加蛋白酶抑制剂减少蛋白降解
2）大蛋白不易溶解，注意减少沉淀损失
3）使用0.45μm孔径的转印膜，否则背景较高4）在转印缓冲液中加入0.01–0.05％SDS，提高转膜效率
5）降低甲醇浓度至10%或以下，可保留凝胶溶胀，协助蛋白转移
6）采用湿转，并延长时间

34.分子量较小的目标蛋白做WB有什么考虑？
小于20kDa的蛋白也会因为一些因素导致检测困难
建议：
1）样品处理时加入核酸酶减少蛋白损失
2）采用Immobilon-PSQ 0.2μm转印膜
3）将甲醇浓度增加至15-20%，以充分去除SDS对膜结合的干扰
4）采用半干转印并设定较低电压
5）使用小分子封闭剂减少蛋白类封闭剂对小分子量目标蛋白的遮蔽，提高检测成功率

35. 磷酸化蛋白做WB应注意哪些问题？
磷酸化蛋白是信号通路中的重要研究对象，往往也是低丰度蛋白。
建议：
1）尽量采用新鲜制备的样本，长期存放的样品其磷酸化状态会发生变化
2）设置阳性对照，或者采用验证的方法进行磷酸化的诱导
3）在裂解液中同时加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，跑胶前始终在低温下操作
4）考虑将磷酸化蛋白富集
5）采用优质磷酸化抗体
6）勿用脱脂牛奶封闭

36.低丰度蛋白做WB有何建议？
低丰度蛋白是WB检测中最常见的一种挑战。
建议：
1）在裂解液中加蛋白酶抑制剂
2）采取组分抽提的方法富集目标蛋白
3）设置阳性对照以确定体系正常
4）带负电荷较多的蛋白（酸性氨基酸Asp和Glu含量高）在电场中移动较快，适当降低电压
5）选用特异性好的抗体
6）使用Immobilon免疫信号增强试剂
7）使用高灵敏度底物。

37.如何选择合适的内参蛋白
根据蛋白质的细胞定位选择最佳内参。
如胞质蛋白常用β-Actin、Tubulin或GAPDH；核蛋白常用Lamin B1、TBP或组蛋白H3；线粒体蛋白常用VDAC1和COXIV等。
注意生理和病理因素可影响内参的表达水平，如某些细胞在缺氧和糖尿病等条件下GAPDH表达调高。还需考虑组织特异性，如β-Actin不适合骨骼肌样品。
38. 什么是荧光western？有什么优点？
传统的Western是用化学发光法来检测膜上的蛋白，基于酶和底物的反应。
荧光Western则是利用标记了荧光素的二抗直接发出的荧光来检测的。
荧光法克服了酶-底物反应动力学速度不稳定的缺点，能真正实现定量；通过选择不同荧光标记的二抗，可同时测定膜上多种蛋白，实现多重检测，这是其最大优点；另外，荧光信号相对稳定，可保持较长时间。

39. 比较一下化学发光和荧光western的优缺点
化学发光法灵敏度更高，可达飞克级（荧光法为皮克级），在测定单个蛋白、判断蛋白是否表达、检测低丰度蛋白时有优势。
化学发光法只能通过剥离-再结合的方式检测不同蛋白，而荧光法可实现多重检测，方便检测翻译后修饰和归一化；化学发光法只能半定量，而荧光法可真正定量；化学发光法信号易饱和，而荧光法通常不会，但荧光法需注意自发荧光和背景问题。

40. 总结一下western blotting
蛋白印迹是多种蛋白质研究的基础，约9%的蛋白质相关论文引用了这种技术。
其核心内容包含三个要素：按大小分离样本中的蛋白质，转移到固相载体上，并使用一抗和二抗检测目标蛋白质。这项1979年诞生的技术虽已年届不惑，并一度面临科学欺诈和数据再现危机，但仍是近十年来蛋白质相关出版物中使用最多的技术，并且有了一些新的发展，仍在变得更强。